Hintergrund/ Konzept

Mukoviszidose oder Cystische Fibrose (CF) ist die häufigste aller seltenen, letaler autosomal-rezessiven Erkrankungen mit einer durchschnittlichen Häufigkeit in der EU von einem in 2000-3000 betroffenen Neugeborenen. CF wird durch Mutationen im CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)-Gen hervorgerufen. CFTR ist ein cAMP-regulierter Chloridkanal des sekretorischen Epithels der Atemwege, der Bauchspeicheldrüse, des Darms, der Gallengänge und weiterer Gewebe. Derzeit sind fast 2000 verschiedene Mutationen im CFTR-Gen bekannt, von denen ~130 pathogen sind da sie die Translation, die Proteinfaltung oder die Funktionsfähigkeit des Chloridkanals (Gating-Mutation) beeinträchtigen. Daher ist eine Therapie zur Wiederherstellung der Funktion des mutierten CFTRs mit Wirkstoffmolekülen von enormer Wichtigkeit. Durch High-Throughput (HT)-Screeningansätze konnten bereits CFTR-Verstärker identifiziert werden, welche die Fähigkeit besitzen, die Kanalaktivität durch verstärktes Gating wiederherzustellen. Des Weiteren konnten für die häufigste CFTR-Mutation (F508del) und der daraus resultierenden Proteinfehlfaltung auch Korrektoren zur Wiederherstellung des fehlerhaften intrazellulären Transports („Trafficking“-Mutation) in vitro identifiziert werden. Der Verstärker Ivacaftor (VX-770) wurde im Jahr 2013 durch die FDA/EMA für die Mutation G551D, und kürzlich auch für weitere acht Gating-Mutationen, zugelassen. Allerdings betrifft diese Mutation nur 4-5% aller CF-Patienten.

Für die meisten CF-Patienten steht noch keine effektive Behandlung mit niedermolekularen Verbindungen zur Verfügung. Bisherige klinische Studien mit homozygoten F508del-Patienten und den wirksamsten Korrektoren (VX-809/661) zeigten nur mäßigen Erfolg. Auch die Kombination der Korrektoren VX-809/661 mit dem Verstärker VX-770 konnte die Lungenfunktion nur minimal verbessern (~4%) und dies auch nur in einigen wenigen Patienten. Des Weiteren tragen nur etwa 40% der CF-Patienten die F508del-Mutation homozygot, und es wird erwartet, dass die Effizienz der Korrektoren bei „Compound-heterozygoten“ Patienten mit nur einem F508del-Allel noch geringer sein wird. Mindestens 15% aller CF-Patienten werden vermutlich ohnehin nicht von den Therapien mit F508del-Korrektoren profitieren, da diese die Mutation gar nicht tragen. Diese Fakten verdeutlichen die große Notwendigkeit, neue Korrektoren für F508del-CFTR und besonders für weitere seltene Trafficking-Mutationen zu identifizieren. Es ist außerdem hervorzuheben, dass aktuelle große Screening-Initiativen basierend auf primären Atemwegszellen nicht in der Lage sind, seltene CF-Mutationen einzubeziehen, da für diese Mutationen homozygotes Lungengewebe generell nicht verfügbar ist. So steht, obwohl A561E mit 6,37% die zweithäufigste Mutation in Portugal ist, dem INSTINCT-Konsortium nur ein einziger A561E-homozygoter Patient zu Verfügung. Primärzellen dieses Patienten könnten zwar für ein sekundäres Screening verwendet werden, würden allerdings mengenmäßig nicht für ein primäres Screening ausreichen. Die Mutation A561E kann in primären Kulturen von CF-Lungenzellen teilweise durch VX-809 korrigiert werden. In Anbetracht der eingeschränkten klinischen Wirksamkeit von VX-809 bei homozygoten F508del-Patienten erwarten wir allerdings auch keine höhere Effizienz in heterozygoten A561E-Patienten. Aus den genannten Gründen sind für diese CF-Patienten zusätzliche Screenings unerlässlich. N1303K ist eine weitere CF-Mutation mit erheblichen Traffickingdefekten die in Südeuropa mit einer Allelfrequenz von bis zu 5% recht häufig auftritt. Wie für seltene Mutationen typisch, sind für diese Mutation keine Patienten, die homozygote Träger sind, verfügbar. Bekannte CFTR-Korrektoren wie VX-809 oder corr-4a zeigen keinerlei Wirkung auf die durch N1303K hervorgerufenen CFTR-Defekte, da sich diese von den F508del Proteinveränderungen unterscheiden und deshalb für die N1303K-CFTR Behandlung wahrscheinlich andere Typen von Korrektoren bzw. auch andere Wirkstoffkombinationen notwendig sein werden. Folglich müssen für F508del und andere Trafficking-Mutationen neue Wirkstoffe identifiziert werden. Aktuelle Daten zeigen, dass eine Kombination von CFTR-Korrektoren und Verstärkern, sowie von Molekülen die einen starken Umsatz des mutierten Proteins verhindern, notwendig sein werden. Bestenfalls sollten diese Kombinationen nicht nur an spezifische CFTR-Mutationen sondern zusätzlich auch an die Patienten individuell angepasst werden, da diese in den meisten Fällen zwei verschiedene Mutationen aufweisen. Des Weiteren erfordert die Komplexität der Prozesse wie Reifung und Umsatz des mutierten CFTRs die Verwendung fortschrittlicher Zellmodelle, mit denen sich die Eigenschaften der am stärksten betroffenen Organe (Lunge, Gallengang, Pankreas und Darm) darstellen lassen. Bestenfalls sollte dies bereits beim Wirkstoffscreening implementiert sein, da unwirksame oder für natives humanes Epithel toxische Verbindungen auf diese Weise sofort aussortiert werden können. Dennoch sind primäre Zellkulturtechniken aufwändig und, trotz neuster Fortschritte, werden Atemwegszellen von Patienten mit seltenen CF-Mutationen nicht in ausreichenden Mengen für HT-Screenings zur Verfügung stehen, da sie oftmals lediglich aus Bronchialabstrichen gewonnen werden können. Hinzu kommt, dass genetische Modifikationen ausdifferenzierter Primärzellen zur Etablierung von Reporterlinien extrem schwierig oder unmöglich sind.

Aus diesem Grund wurden bisher die meisten Screenings mit immortalisierten Zelllinien durchgeführt, die entsprechende CFTR-Mutationen und Halogenid-Indikatoren überexprimieren. Nur die erfolgversprechendsten Verbindungen wurden anschließend in primären humanen bronchialen Epithelzellen validiert und zeigten eine sehr variable und eingeschränkte Wirksamkeit. Da immortalisierte CFTR-überexprimierende Zelllinien nicht die physiologischen Eigenschaften der betroffenen Epithelzellen zeigen, und sich daher nur schlecht eine Vorhersage bezüglich ihrer klinischen Effizienz machen lässt, ist die Entwicklung alternativer Screeningmethoden essenziell.

 

Mit der Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) steht heute eine weitere patienten- und krankheitsspezifische Zellquelle für HT-Screenings zur Verfügung. Im Gegensatz zu primären bronchialen Epithelzellen, weisen iPS-Zellen ein unbegrenztes Vermehrungs- und Differenzierungspotential auf. iPS-Zellen können aus leicht zugänglichen Zellquellen hergestellt werden und es wurden bereits enorme Fortschritte für ihre Massenproduktion sowie ihre gerichteten Differenzierung gemacht. Des Weiteren ist für das vorliegende Projekt die Möglichkeit zur gezielten Genmodifizierung der hiPS-Zellen mithilfe von „Transcription Activator-like Effector Nukleasen“ (TALENs) von großer Bedeutung. Dies ermöglicht die Generierung von Patienten- und CFTR-Mutations-spezifischen Zelllinien mit integriertem Halogenid-sensitivem YFP oder einem CFTR-Trafficking-Reportersystem. Im Gegensatz zu aktuellen, auf primären Zellen oder Darmorganoiden basierenden Screening-Initiativen, erlaubt unser Ansatz die einzigartige Möglichkeit zum spezifischen Screening nach Korrektoren seltener Trafficking-Mutationen und zur Validierung der identifizierten Wirkstoffe in iPS-Zell-basiertem, organspezifischem Epithel. Dies erreichen wir durch die Integration eines CFTR-Reporters in das F508del-Allel „Compound-heterozygoter“ CF-iPS-Zellen wobei das Allel mit der seltenen Mutation, erhalten bleibt. Genetische Modifikationen von Darmorganoiden erfordern eine Antibiotikaselektion, um transgene Stammzellklone zu erhalten. Wir konnten jedoch eine „rückstandslose“ Genmodifikation isogener iPS-Zelllinien mithilfe von TALE-Nukleasen und einzelsträngigen Oligonukleotiden ohne Antibiotikaselektion oder Durchflusszytomtrie zeigen. Unsere einzigartigen iPS-Reporterzellen können in CF-relevante Zelltypen differenziert und anschließend in HT-Screenings eingesetzt werden. Des Weiteren können diese iPS-Derivate zur fortgeschrittenen Validierung der identifizierten Verbindungen und ihrer Kombinationen in neuartigen elektrophysiologischen und organtypischen Zellkultursystemen zur Messung weiterer Parameter wie Mukussekretion, bioaktivem Fettmetabolismus, Entzündungen und Gewebe-Remodelling verwendet werden. Für diesen Zweck stehen automatisierte konfokale Screeningplattformen zur Verfügung. Langfristig werden respiratorische Derivate genkorrigierter patientenspezifischer iPS-Zellen die Umsetzung neuer Konzepte zur personalisierten ex vivo Gentherapie von CF-Patienten ermöglichen.

Aus den genannten Gründen möchten wir genetisch modifizierte patientenspezifische iPS-Zellen zusammen mit CF-spezifischen primären Lungenepithelzellen als eine innovative und vielversprechende Plattform etablieren, um die verschiedenen CF-Krankheitsbilder genauer zu charakterisieren und neue Wirkstoffe zur funktionellen Korrektur organspezifischer Phänotypen der unterschiedlichen (und besonders der seltenen) CFTR-Trafficking-Mutationen zu identifizieren.